מה זה Sulforaphane?

Sulforaphane הוא phytochemical, חומר בתוך קבוצת isothiocyanate של תרכובות organosulfur, שנמצאו ירקות cruciferous, כגון ברוקולי, כרוב, כרובית, וכרוב ניצנים. זה יכול להיות גם למצוא chok בוק, כרוב, collards, חרדל ירוק ו watercress. מחקרים הראו כי sulforaphane יכול לסייע במניעת סוגים שונים של סרטן על ידי הפעלת הייצור של Nrf2, או גורם גרעיני הקשור ל- erythroid 2, גורם תעתיק המווסת מנגנוני נוגדי חמצון מגנים השולטים בתגובת התא לחמצונים. מטרת המאמר הבא היא לתאר את תפקודו של סולפוראפן.

תַקצִיר

KEAP1-Nrf2-ARE נוגדי חמצון המערכת היא אמצעי העיקרי שבו תאים מגיבים ללחץ חמצוני ו xenobiotic. Sulforaphane (SFN), isothiocateate אלקטרופי המופק ירקות cruciferous, מפעיל את מסלול KEAP1-Nrf2-ARE והפך מולקולה של עניין בטיפול במחלות בהם מתח חמצוני כרוני משחק תפקיד אטיולוגי מרכזי. אנו מדגימים כאן כי המיטוכונדריה של בתרבית, פיגמנט רשתית אפיתל בתרבית, (RPE-1) תאים שטופלו SFN לעבור hyperfusion כי הוא עצמאי של שניהם Nrf2 ואת מעכב cytoplasmic KEAP1. מיטוכונדריאלי היתוך כבר דיווחו להיות cytoprotective על ידי עיכוב היווצרות הנקבוביות במיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס, ועקבית עם זה, אנו מציגים Nrf2 עצמאית, cytoprotection של תאים שטופלו SFN חשופים אפופטוזיס, inducer, staurosporine. מבחינה מכנית, SFN מקטין את גיוס ו / או שימור של גורם ביקוע מסיס Drp1 למיטוכונדריה ו peroxisomes אבל אינו משפיע על שפע Drp1 הכוללת. נתונים אלה מראים כי התכונות המועילות של SFN מתרחבות מעבר להפעלת מערכת KEAP1-Nrf2-ARE ומצדיקות חקירה נוספת, בהתחשב בשימוש הנוכחי של הסוכן בניסויים קליניים מרובים.

מילות מפתח: Sulforaphane, Nrf2, Drp1, מיטוכונדריה, ביקוע, היתוך, אפופטוזיס

מבוא

Sulforaphane הוא מעכב Nrf2 עצמאי של ביקוע מיטוכונדריאלי

Sulforaphane (SFN) הוא מתחם isothiocyanate נגזר בתזונה הנפוצה ביותר מן ירקות cruciferous [56]. היא נוצרת בצמחים כתגובה קסנוביוטית לטריפה באמצעות שחרור שלפוחית ​​של מירוזינאז הידרוליטי של אנזים מתאים פגומים; אנזים זה ממיר glucosinolates כדי isothiocyantes [42]. במהלך שני העשורים האחרונים, SFN מאופיין בהרחבה על תכונות האנטי סרטניות, האנטי-אוקסידנטיות והמיקרוביאליות שלו (57). חלק ניכר מיעילות זו יוחס ליכולת של SFN כדי לווסת את נתיב איתות התגובה KEAP1-Nrf2-Nrf29-NRf2, למרות שפעולות נוספות של המתחם זוהו, כולל עיכוב פעילות של היסטון דקסטילז והתפתחות מחזור התא [ 3]. Nrf1 הוא גורם השעתוק נוגדי החמצון הראשי ובתנאים של הומיאוסטזיס, יציבותו מדוכאת באמצעות הפעולה של Cullin20KEAP2 ubiquitin ligase [3]. באופן ספציפי, Nrf1 הוא גויס את Cullin1KEAP2 ligase על ידי מחייב את מתאם המצע דימריק KEAP15 ו הוא שונה לאחר מכן עם שרשראות polyUb כי היעד גורם שעתוק עבור השפלה מתווך proteasome. המחזור הקונסטרוקטיבי הזה מגביל את מחצית החיים של Nrf30 בתאים לא מסודרים ל- 33 דק '[46], [55], [1], [151]. בתגובה לסוגים רבים של לחץ, בעיקר מתח חמצוני, KEAP1, חלבון עשיר בסיסטאין, משמש כחישן חיישן, ושינוי חמצוני של ציסטאין קריטיים, במיוחד C2, של KEAP1 מפרק את Nrf3-KEAP2 מ- CUL8 ובכך מונע השפלה Nrf20 [ 55], [2], [151]. יש לציין, SFN, ואולי אחרים Nrf1 activators, לחקות את הלחץ החמצוני על ידי שינוי C21 של KEAP2 למשל [2]. ייצוב של Nrf19 מאפשר טרנסלוקציה שלה לגרעין שבו הוא גורם לביטוי של הסוללה של שלב II נוגדי חמצון ו detoxification גנים. Nrf16 נקשר אלמנטים נוגדי חמצון מקדם התגובה (ARE) של גנים היעד שלה דרך ההטרודימריזציה עם חלבונים המאפיה קטן [41]. מערכת זו מציגה תגובה דינמית ורגישה לחומרים נוגדי חמצון עקיפים כמו SFN, רדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי המיטוכונדריה [XNUMX] או מקורות פיזיולוגיים אחרים של מתח חמצוני [XNUMX].

המיטוכונדריה הם אורגנים דינמיים, תת-תאיים המווסתים שורה של תפקודים תאיים הנעים בין ייצור ATP ומאגר סידן תאיים לבין רגולציה של ויסות ואפופטוזיס [13], [49]. המיטוכונדריה מייצגת גם את המקור העיקרי של מינים של חמצן תגובתי (ROS) בתוך התא. ראוי תקנה של תפקוד המיטוכונדריה ולכן יש צורך לייעל את הייצור ATP כדי לענות על הצרכים הסלולר בעת ובעונה אחת למזער את ההשפעות המזיקות של ייצור רדיקלי חופשי מוגזם. דרישה קריטית לאפנון דק של תפקוד המיטוכונדריה היא היכולת של המיטוכונדריה לתפקד באופן עצמאי כמכונות ביוכימיות וכחלק מרשת רחבה ומגיבה.

מורפולוגיה רשתית המיטוכונדריה ותפקוד נקבעים על ידי איזון מוסדר בין ביקוע היתוך. ביקוע מיטוכונדריאלי נדרש לתורשת בת הבת של המיטוכונדריה במהלך חלוקת התא [28], כמו גם להשפעה הסלקטיבית, האוטופאפית של המיטוכונדריה המופרזת או הפגומה, שנקראת mitophagy [1]. לעומת זאת, היתוך נדרש עבור השלמת של הגנום המיטוכונדריה ושיתוף של רכיבי שרשרת האלקטרון תחבורה בין המיטוכונדריה השכנה [54]. ברמה המולקולרית, ביקוע המיטוכונדריאלי היתוך מוסדרים על ידי GTPases גדול, דמוי דינמי. שלושה אנזימים בעיקר מסדירים פיוז'ן: Mitnusins ​​1 ו- 2 (Mfn1 / 2) הם שני חלבונים ממברניים חיצוניים המווכים את היתוך הממברנה החיצונית באמצעות אינטראקציות הטרוטיפיות בין המיטוכונדריה הסמוכה [15], [25], [37], בעוד ש- OPA1 הוא פנימי חלבון הממברנה בו זמנית מבטיח קישוריות מטריצה ​​על ידי ויסות ריתוך של ממברנות פנימיות [5]. פעילות ה- GTPase של כל שלושת החלבונים נדרשת עבור היתוך חזק [5], [18], ו- OPA1 מוסדר עוד יותר על ידי פרוטאוליזה מורכבת בתוך הממברנה הפנימית המיטוכונדריה על ידי הפרוטאזות OMA1 [14], PARL [6] ו- YME1L [45 ]. חשוב לציין, פוטנציאל קרום מיטוכונדריה שלם נדרש פיוז 'ן יעיל על מנת לדכא את האינטגרציה של המיטוכונדריה פגום ובריא [26].

מיטוכונדריאלי ביקוע הוא בעיקר catalyzed על ידי חלבון cytosolic הנקרא Dynamin הקשורים חלבון 1 (Drp1 / DNM1L). Drp1 הוא גויס מן cytosol לאתרים פוטנציאליים של ביקוע על הממברנה החיצונית המיטוכונדריה [43]. הקולטנים העיקריים עבור Drp1 על הממברנה החיצונית הם גורם הביקוע המיטוכונדריה (Mff) [32] ובמידה פחותה יותר, ביקוע 1 (Fis1) [51]. בנוסף, קולטן דמה, MIEF1 / MiD51, התגלה כי פועל להגביל עוד יותר את הפעילות של חלבון Drp1 באתרי ביקוע פוטנציאליים [58]. לאחר מעוגן בקרום החיצוני המיטוכונדריה, Drp1 oligomerizes לתוך מבנים דמויי ספירלה סביב הגוף של המיטוכונדריה ולאחר מכן מנצל את האנרגיה הנגזרת GTP hydrolysis לתווך scission הפיזי של הממברנות החיצוניות והמיטוכונדריאלי [17]. Endoplasmic reticulum- tubules הנגזרים לפעול כמחילה הראשונית של המיטוכונדריה לפני oligomerization Drp1, מדגיש את ההתגלות כי מיטוכונדריה לא מכווצים רחבים יותר מאשר היקף מתירנית של ספירלה Drp1 הושלמה [12]. אקטין הדינמיקה גם חשוב עבור ER- המיטוכונדריה אינטראקציות שקודמים ביקוע המיטוכונדריה [24]. בנוסף לתפקידה ב ביקוע המיטוכונדריה, Drp1 מזרז את ביקוע של peroxisomes [40].

Drp1 דומה מאוד לחלבון הדינמין המאופיין היטב בכך ששני החלבונים מכילים תחום GTPase מסוף N, תחום ביניים קריטי לאוליגומיזציה עצמית, ומנגנון C-Terminal GTPase של מסוף C [31]. Drp1 משיגה סלקטיביות עבור ממברנות המיטוכונדריה באמצעות שילוב של אינטראקציות עם חלבונים קולטן Mff ו Fis1 וגם דרך זיקה שלה עבור cardiolipin phospholipid ספציפי המיטוכונדריה דרך ייחודי B- הוספת תחום של Drp1 [2]. Drp1 בדרך כלל קיים כמו homotetramer ב cytoplasm, ואת הרכבה סדר גבוה יותר באתרי ביקוע המיטוכונדריה מתווכת על ידי התחום התיכון של Drp1 [3].

בהינתן הקישור המרומז בין תפקוד המיטוכונדריה לבין מסלול KEAP1-Nrf2-ARE, בדקנו את ההשפעות של הפעלת Nrf2 על המבנה והפונקציה המיטוכונדריאלית. אנו מדגימים כאן כי SFN גורם מיטוכונדריה hyperfusion זה, באופן בלתי צפוי, הוא עצמאי הן Nrf2 ו KEAP1. השפעה זו של SFN היא באמצעות עיכוב של הפונקציה Drp1. אנו מראים עוד כי SFN מעניק התנגדות אפופטוזיס כי הוא Nrf2 עצמאית לחקות כי נצפתה תאים מדולדלת של Drp1. נתונים אלה מצביעים באופן קולקטיבי כי בנוסף לייצוב והפעלת Nrf2, SFN מודולציה של הדינמיקה המיטוכונדריאלית ומשמרת כושר התאוששות והישרדות.

תוצאות

הזרקת נוזלים

במהלך לימוד ההשפעות של הפעלת Nrf2 על דינמיקת הרשת המיטוכונדריאלית, גילינו שטיפול בתאי אפיתל פיגמנט אנושי (RPE-1) מונצח עם sulforaphane (SFN), מפעיל חזק של איתות Nrf2, גרם להתמזגות חזקה של רשת המיטוכונדריה בהשוואה לתאי בקרה שטופלו ברכב (איור 1 א 'וב'). המורפולוגיה של המיטוכונדריה בתאים אלה דמתה מאוד לזו של המיטוכונדריה בתאים המדוללת על ידי siRNA של Drp1 האנדוגני, גורם הביקוע המיטוכונדריאלי העיקרי (איור 1 א). תוצאה זו העלתה את הרעיון המסקרן לפיה ביקוע ומיטוזיה של המיטוכונדריה מגיב ישירות לרמות Nrf2 בתא. עם זאת, גירוי של תאים עם מייצבים ומפעילי Nrf2 אחרים כגון מעכב הפרוטאזום MG132, ה- tBHQ הפרו-אוקסידנט או מציאה של מעכב Nrf2 KEAP1 לא גרם להתמזגות מיטוכונדריאלית (איור 1 א 'ו- B). ייצוב Nrf2 על ידי מניפולציות אלה אושר על ידי סופג מערבי ל- Nrf2 אנדוגני (איור 1 ג). יתר על כן, ביטוי של Nrf2 היה ניתן לביטול עבור היתוך המיטוכונדריה המושרה על ידי SFN, שכן מציאה של Nrf2 אנדוגני עם siRNA לא הצליחה להתנגד לפנוטיפ זה (איור 1DF). מכיוון ש- SFN מגרה את המסלול KEAP1-Nrf2-ARE על ידי שינוי קוולנטי של שאריות ציסטאין של KEAP1 [21], דפקנו את KEAP1 בכדי לטפל אם היפרפוזיה של המיטוכונדריה המושרה על ידי SFN מגורה דרך מסלול תלוי ב- KEAP1, אך בלתי תלוי ב- Nrf2. עם זאת, דלדול KEAP1 לא הצליח לבטל היתוך מיטוכונדריאלי המושרה על ידי SFN (איור 1G I). למעשה, SFN הפך את המורפולוגיה הפרו-ביקוע הנגרמת על ידי דלדול KEAP1 (איור 1G, לוח ב לעומת לוח d). תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול ב- SFN גורם לאיחוי מיטוכונדריאלי ללא תלות במסלול KEAP1-Nrf2-ARE הקנוני והביא אותנו לחקור האם SFN משפיע ישירות על רכיבי מכונת הביקוע או היתוך המיטוכונדריה.

Sulforaphane פוגעת באיגוד המיטוכונדריאלי של Drp1

בהתבסס על הממצא כי טיפול ב- SFN גורם לייתר יתר של המיטוכונדריה, אנו מניחים שפנוטיפ זה הוא תוצאה של פעילות פיוז'ן מוגזמת או עיכוב בפעילות הביקוע. כדי להפלות בין שתי אפשרויות אלה, השווה את המורפולוגיה של peroxisomes בנוכחות והיעדר SFN. Peroxisomes דומים המיטוכונדריה בכך שהם אורגני דינמי את הצורה ואת אורך אשר נמצאים כל הזמן שטף [44]. פרקיזומים מכילים הן את Fis1 והן את Mff בממברנה החיצונית שלהם, וכתוצאה מכך, הם מטרות עבור ביקוע מתווך Drp1 [22], [23]. עם זאת, peroxisomes לא לנצל את מכונות היתוך של רשת המיטוכונדריה וכתוצאה מכך, לא לעבור פיוז 'ן [39]. במקום זאת, ביקוע peroxisomal מתנגד על ידי התארכות של peroxisomes הקיים באמצעות תוספת נובו של ממברנות וחלבונים [44]. בגלל peroxisomes חוסר Mfn1 / 2 ו OPA1, אנו בטוחים שאם SFN מפעיל את מנגנון היתוך ולא מעכב את מנגנון הביקוע, אורך peroxisome לא יושפע. בתאים שטופלו ברכב, פרוקסיזומים מתוחזקים כארוניים קצרות, עגולות, בורגיות (איור 2, לוחות b ו- d). עם זאת, טיפול SFN גדל אורך peroxisome על ידי ~ 2 לקפל לעומת תאים שליטה (איור 2, לוחות F ו- H). יתר על כן, רבים של peroxisomes היו צבט ליד המרכז, המציין פגם scission פוטנציאל (איור 2, לוח ח, ראשי חצים). כמו כן, peroxisomes בתאים transfected עם drp1 siRNA היו ארוכים באופן ארוך (איור 2, לוחות J ו- L), המאשר כי Drp1 נדרשת עבור ביקוע peroxisomal וטוען כי SFN- טיפול גורם המיטוכונדריה ו פנוטיפים פנוטיזומלי על ידי שיבוש מנגנון הביקוע.

הבא קבענו כיצד SFN מגביל את פונקציית Drp1. האפשרויות כללו ירידה ברמות הביטוי, גיוס / שימור במיטוכונדריה, אוליגומריזציה או פעילות אנזימטית של ה- GTPase. גירעון בכל אחד מאלה יביא להפחתת ביקוע מיטוכונדריאלי ולעילוי יתר. לא זיהינו שינויים ניתנים לשחזור ברמות החלבון Drp1 לאחר הטיפול ב- SFN (איורים 1C ו- 3A), ולכן הסקנו כי SFN אינו משנה את יציבות ה- Drp1 או את הביטוי, בהתאמה ל- Drp1 בעל מחצית חיים של> 10 שעות [50] וטיפולי ה- SFN שלנו קצרים יותר. לאחר מכן, בדקנו האם SFN השפיע על גיוסו או שימורו של Drp1 למיטוכונדריה. מחקרי חלוקה הראו כי SFN גרם לאובדן Drp1 מהשבר המיטוכונדריאלי (איור 3 א, נתיבים 7 8 ואיור 3 ב). כפי שדווח בעבר [43], רק חלק קטן מ- Drp1 (~ 3%) קשור לרשת המיטוכונדריה בכל זמן נתון בתנאי מצב יציב, כאשר מרבית האנזים שוכן בציטופלזמה (איור 3 א ', נתיבים 5 8. ). נתוני חלוקה אלה אושרו באמצעות ניתוח שיתוף לוקליזציה אשר הראה ירידה של ~ 40% במוקדי Drp1 המנוקדים, המנוקדים במיטוכונדריה לאחר טיפול SFN (איור 3 ג 'ו- D). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שההיתוך המיטוכונדריה המושרה על ידי SFN נובע, לפחות באופן חלקי, מהקשר המוחלש של Drp1 עם המיטוכונדריה. הנתונים שלנו אינם מבחינים בין אם SFN מפריע לגיוס המיטוכונדריה לעומת החזקת המיטוכונדריה של Drp1, או שניהם, מכיוון שניתוח ה- Drp1 האנדוגני לא היה אפשרי להמחשה של ה- GTPase באמצעות מיקרוסקופ של תאים חיים.

הגנה על סולפורפאן נגד אפופטוזיס המושרה על ידי סטאוארוספורין ללא תלות ב- Nrf2

עבודה קודמת הראתה כי ביקוע מיטוכונדריאלי מותר ביצירת נקבוביות בקרום המיטוכונדריה החיצוני שנוצר על ידי Bax / Bak במהלך אפופטוזיס [11]. הוכח כי Drp1 גויס באופן סלקטיבי למיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס [11] ובהתאם לכך, נצפו המיטוכונדריה מקוטעת בשלב מוקדם של התהליך [27]. לעומת זאת, עיכוב ביקוע מיטוכונדריאלי נחשב כמעכב אפופטוזיס על ידי חסימת היווצרות נקבוביות הממברנה החיצונית המאפשרות שחרור ציטוכרום c [53]. בהתאם, היתוך גירוי של המיטוכונדריה מעכב את התקדמות האפופטוזיס הנגרמת על ידי תרכובות כולל סטאורוספורין (STS) [14]. כדי לקבוע אם SFN מגן על תאי RPE-1 מפני אפופטוזיס בתיווך STS, ואם כן, האם הדבר דורש Nrf2, הקמנו assay כדי לגרום בקלות למחשוף פולי פולימראז ADP ריבוז (PARP), מצע של קספאז -3 מופעל וסמן סופי של אפופטוזיס. טיפול בתאי RPE-1 עם STM של 1M במשך 6 שעות גרם רק למחשוף צנוע מאוד של PARP, אולם זה נמנע על ידי טיפול משותף ב- SFN (למשל, איור 4 א, מסלול 3 לעומת 4). כדי להגדיל את החוסן של assay זה, רגישנו עוד יותר תאים לאפופטוזיס המושרה על ידי STS על ידי טיפול מקדים בהם ב- siRNA המכוון לגורם האנטי-אפופטוטי, Bcl-XL. טיפול מקדים זה הפחית את הביטוי של Bcl-XL וקידם באופן ניכר את מחשוף PARP כפונקציה של זמן שנחשף ל- STS (איור 4B, השווה מסלול 2 לנתיבים 4 10). חשוב לציין, שעתיים של טיפול מקדים במחשוף PARP ממתן באמצעות SFN בתאים שנחשפו ל- STS (איור 2 ג ', נתיב 4 לעומת 3 ונתיב 4 לעומת 5). כמו כן, תאים שהתרוקנו באופן יציב מ- Nrf6 על ידי CRISPR / Cas2 הוגנו באופן דומה מפני רעילות STS על ידי טיפול מקדים ב- SFN (איור 9 ג, מסלול 4 לעומת 11 ונתיב 12 לעומת 13 ואיור 14 ד). הגנה זו נצפתה באמצעות מחשוף PARP (איור 4C ו- D) ומורפולוגיה תאית (איור 4E) כקריאות. היעילות של דלדול Nrf4 על ידי CRISPR / Cas2 אושרה על ידי סופג מערבי (איור 9C, כתם Nrf4). כצפוי, דלדול תאים של Drp2, שמניב גם פנוטיפ של הזעת יתר (איור 1 א), חסם גם מחשוף PARP בתגובה ל- STS בהשוואה לתאי בקרה שהודגרו ב- SFN (איור 1F ו- G). יחד, ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם SFN המעניק הגנה מפני אפופטוזיס באמצעות יכולתו להגביל את תפקוד ה- Drp4, ללא תלות בייצוב והפעלה של Nrf1.

דיון

גילינו כי SFN מודולציה של ביקוע המיטוכונדריה / דינמי היתוך עצמאי של השפעותיו על מסלול KEAP1-Nrf2-ARE. זה מסקרן בגלל הקשר ההנחה בין תפקוד המיטוכונדריאלי לייצור ROS ואת הצורך של squelching המיטוכונדריה הנגזרות רדיקלים באמצעות הפעלה של Nrf2. ההשפעה הפונקציונלית הנוספת של SFN הינה בעלת חשיבות פוטנציאלית בהתחשב בניסויים הקליניים של 30 אשר נמצאים כעת בבדיקת SFN לטיפול במגוון מחלות כולל סרטן ערמונית, מחלת ריאות חסימתית ומחלת תאי מגל [7], [10], [ 47].

כי SFN הוא isothiocyanate [56] והיא מפעילה איתות Nrf2 על ידי acylating קריטי CEAP1 קריטיים כדי לדכא השפלה Nrf2 [21], נובע מכך SFN מפעילה את ההשפעות הפרו-פיוז'ן שלה על ידי מווסת את הפעילות של ביקוע או גורם היתוך באמצעות שינוי ציסטאין . הנתונים שלנו תומכים מאוד Drp1 להיות מוסדר שלילי על ידי SFN אם כי אם GTPase הוא יעד ישיר של acylation נשאר להבהיר. למרות פער הידע הזה, הפונקציה של Drp1 מתבטאת בבירור על ידי SFN, שכן שני המיטוכונדריה וה- peroxisomes הופכים ל hyperfused בתגובה לטיפול ב- SFN, ואלו הארגנים חולקים את Drp1 לאירועי scission שלהם [38]. בנוסף, SFN מקטין את כמות Drp1 כי localizes ו מצטבר במיטוכונדריה (איור 3). 3). בגלל הניסויים שלנו נעשו עם כל החלבונים האנדוגניים, זיהוי שלנו של Drp1 באתרי הביקוע המיטוכונדריאלי הוא בתנאים של מצב יציב, וכתוצאה מכך, אנחנו לא יכולים להבחין בין גיוס לעומת פגם שימור של האנזים שנגרם על ידי SFN. יתר על כן, אנחנו לא יכולים לחסל את האפשרות כי SFN acylates קולטן במיטוכונדריה (Fis1 או Mff) לחסום גיוס Drp1 עדיין, אנו חושדים כי Drp1 הוא שונה ישירות. Drp1 יש תשע ציסטאין, שמונה מהם מתגוררים בתוך התחום התיכון הנדרש עבור oligomerization [3], ואחד מהם מתגורר ב- GTPase Effector Domain (GED) ב C- הטרמינל של Drp1. Acylation ישיר של כל אלה ציסטאין עלול לגרום לליקוי פעילות Drp1 ולכן לבסס את ההשפעה של SFN על הדינמיקה המיטוכונדריאלי. יש לציין כי עבודה קודמת מצביעה על כך שליקויים באוליגומריזציה ופעילות קטליטית יכולים לבטל את החזקתה של Drp1 במיטוכונדריה [52]. Cys644 בתחום GED הוא יעד אטרקטיבי במיוחד המבוסס על עבודה קודמת מראה כי מוטציה של מוטציות phenocopies ציסטאין זה הפוגע בפעילות Drp1 GTPase [4] וכי זה ציסטאין מסוים הוא שונה על ידי electroiles thiol- תגובתי [9]. החלטה של ​​שאלה זו מצטיינים ידרוש אימות ספקטרומטרית מסה.בסיכום, זיהינו רומן, פונקציה cytoprotective עבור SFN המתחם קלינית רלוונטית. בנוסף להפעלת מאסטר אנטי oxidant גורם שעתוק Nrf2, SFN מקדם מיטוכונדריה ו היתוך peroxisomal, ואת האפקט הזה הוא עצמאי של Nrf2. המנגנון המונח ביסודו של התופעה כרוך בהקטנת תפקוד ה- GTPase Drp1, המתווך העיקרי של ביקוע המיטוכונדריה והבקוע הפרוקסומלי. אחת התוצאות העיקריות של היתוך המיטוכונדריאלי של SFN בתיווך היא שהתאים הופכים להיות עמידים בפני ההשפעות הרעילות של staurosporine של אפופטוזיס. פעולה זו נוספת cytoprotective של SFN יכול להיות כלי קליני מסוים של מחלות נוירודגנרטיבים רבים אשר לגיל הוא גורם הסיכון המוביל (למשל, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ניוון מקולרי הקשורים לגיל), כמו אלה מחלות נקשרו עם אפופטוזיס ו מופחת רמות ו / או dysregulation של Nrf2 [35], [36], [48].

חומרים ושיטות

אפופטוזיס מבחני

תאים נזרעו והועברו באמצעות siRNA כמפורט להלן. התאים טופלו מראש ב- 50 M M sulforaphane למשך שעתיים כדי לגרום לאיחוי מיטוכונדריאלי ואז טופלו ב- 2 M staurosporine כדי לגרום לאפופטוזיס. בזמן הקציר, התקשורת נאספה בצינורות בודדים ונתונה לצנטריפוגה במהירות גבוהה לתאי אפופטוטיים גלולה. גלולה תאית זו שולבה עם תאים חסידים ופורקה במאגר Laemmli מרוכז פי 1. דוגמאות סופחו סופג מערבי נגד PARP.

CRISPR / Cas9 דור הבניה

כדי ליצור LentiCRISPR / eCas9 1.1, LentiCRISPR v2 (addgene #52961) היה לחתוך הראשון עם Age1 ו BamH1. לאחר מכן, SpCas9 מ 9 (ADGEN #1.1) היה PCR מוגבר עם age71814 ו BamH1 overhangs באמצעות פריימרים הבאים (קדימה AGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC, הפוך AAGCGCGGATCCCTTTTTTTTTTTTGTTGGTGGGGG) ו ligated לתוך וקטור לחתוך לעיל. sgRNA רצפים נקבעו באמצעות Benchling.com. פרמטרים הוגדרו למקד את רצף הסימול עם הציונים הגבוהים ביותר על היעד והיעד הנמוך ביותר. רצפים הבאים (רצף מיקוד הדגיש, HS sgNFE1L2 # 2 תחושה CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, antisense AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE1L2 # 2 תחושה CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT, AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC antisense; hs sgNFE2L2 # 2 תחושה CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, antisense AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC) היו מרותק ו ligated לתוך BsmB3 לחתוך LentiCRISPR / eCas1 9. Lentivirally נגוע בתאי RPE-1.1 נבחרו עם puromycin ומתוחזק כאוכלוסייה מאוכלס. נוקאוט אושרה על ידי immunofluorescence ו סופג המערבי.

תרבות תאים טרנסקציות

תאי אפיתל של פיגמנט הרשתית האנושי שהומרו בטלומראז (RPE-1) (ATCC) היו בתרבית במדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) המכיל גלוקוז 1 גרם / ליטר בתוספת פניצילין, סטרפטומיצין, קוקטייל חומצה אמינית 1X לא חיוני (Life Technologies), ו 10% סרום שור עוברי (טכנולוגיות חיים). עבור transfections siRNA, 30,000 תאים / מ"ל ​​נזרעו בן לילה. התאים קיבלו 35,000 ננומטר siRNA מדולל ב- DMEM ללא סרום ובשילוב עם ריאגנט transfection של אינטרפרין 10% (PolyPlus). לצורך רגישות לאפופטוזיס, התאים קיבלו 0.3 ננומטר Bcl-XL siRNA. תאים נקצרו 1-2 ימים לאחר transfection.

כימיקלים, נוגדנים ואוליגוס siRNA

נוגדנים כנגד? -טובולין (איתות תאים),? -טובולין (סיגמא), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (איתות תאים), PMP70 (Abcam) ו- Tom20 (BD Biosciences) ) שימשו בדילול 1: 1000 לצורך כתם מערבי ולחיסון פלואורסצנטי. נוגדן ארנבים פנימי ואנטי- Nrf2 שימש בשעה 1: 2000 לצורך סופג מערבי [34], [59]. Sulforaphane (Sigma) ו staurosporine (Tocris) שימשו ב 50? M ו 1? M בהתאמה. siRNAs נגד Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (איתות תאים) ו- Bcl-XL (איתות תאים) שימשו ב -10 ננומטר, אלא אם כן צוין אחרת.

Immunofluorescence ו ב תיוג Vivo

תאים שנזרעו על כיסויי זכוכית בגודל 18 מ"מ טופלו ברכב או בתרופה, נקבעו בפורמלדהיד של 3.7% ואז הוחדרו ב- 0.2% טריטון X-100 / PBS על קרח למשך 10 דקות. נוגדנים ראשוניים הודגרו באלבומין בסרום שור 3% (BSA) ב- PBS למשך הלילה ב -4 CC. בעקבות שטיפות PBS, הודגרו התאים למשך שעה אחת בנוגדנים משניים הניתנים למין, Alexa1- או Alexa488-, מצומדות (מדולל 546: 1) ו- 1000 µg / mL DAPI (Sigma) ב- 0.1% BSA / PBS. המיטוכונדריה הוצגה באמצעות דמוי חיסון אנטי-טומ 3 או באמצעות דגירת תאים ב- 20 ננומטר MitoTracker אדום CMXRos (Molecular Probes, Inc.) ב- DMEM ללא סרום למשך 200 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע.

מיקרוסקופיה וניתוח תמונה

דגימות אימונופלואורסצנטיות נצפו במיקרוסקופ קונפוקלי LSM710 (קרל זיס). צילומי המיקרו תפסו באמצעות מטרות טבילה בשמן 63X או 100X ותמונות שהותאמו ושופרו באמצעות Adobe Photoshop CS6. ניתוח שיתוף לוקליזציה בוצע באמצעות Carl Zeiss LSM710 שיתוף לוקליזציה תכונה עם ספים שנקבעו באופן ידני תוך עיוור לזהות הדגימות. פסי קנה מידה לכל אורכו, אלא אם כן צוין אחרת, הם 10 מטר. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית הוערכה על ידי ניקוד עיוור. אם המיטוכונדריה של התא נשמרה כנקודה מרובה, עגולה ומופלית, התא הושג כ'בקעה '. אם לא ניתן היה להבדיל בין המיטוכונדריה האישית וכל רשת המיטוכונדריה נראתה רציפה, התא הושג כ'התמזגות '. כל שאר התאים, כולל אלה עם המיטוכונדריה מקובצים, זכו לציון "ביניים".

חלוקה תת-תאית

תאי RPE-1 גודלו למפגש. בעקבות שטיפת PBS, התאים הועברו לצנטריפוגה ב 600 גרם למשך 10 דקות והושעו מחדש במאגר בידוד 600 ליטר (210 מ"מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ MOPS, 1 מ"מ EDTA pH 7.4 + 1 מ"מ PMSF). ההשעיה הוזרה 30 פעמים במכשיר הומוגניזציה של Dounce. חלק מההומוגנייט נשמר כ- lysate של תאים שלמים. השאר היה נתון לצנטריפוגה ב 800 גרם למשך 10 דקות לגרעיני גלולה. Supernatants הועברו צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 10 דקות כדי לנקות את הגרעינים הנותרים ואת התאים unlysed. תגובת שיקוע זו עברה צנטריפוגה ב 15,000 גרם במשך 15 דקות לגלולה של המיטוכונדריה. תגובת שיקוע הטבעית נשמרה כשבר ה"ציטוזולי ". הגלולה נשטפה בעדינות עם PBS והושעה מחדש במאגר בידוד. ריכוז החלבון של כל שבר נמדד על ידי בדיקת חומצה דו-סינכונינית (BCA) וכמויות שוות של חלבון נפתרו על ידי SDS-PAGE.

המערבי סופג

תאים נשטפו ב- PBS והופתרו במאגר סולביזציה של Laemmli פעמיים (2 מ"מ טריס [pH 100], 6.8% SDS, 2% כחול ברומופנול, 0.008% 2-mercaptoethanol, 2% גליצרול ו- 26.3% Pyrinin Y). Lysates היו מבושלים במשך 0.001 דקות לפני הטעינה על ג'לים polyacrylamide נתרן dodecyl סולפט (SDS). חלבונים הועברו לקרומי ניטרוצלולוזה והקרומים נחסמו למשך שעה בשעה 5% חלב / TBST. נוגדנים ראשוניים דוללו בחלב / TBST של 1% והודגרו עם הכתם בן לילה ב -5 CC. נוגדנים משניים מצומדים חזרת (HRP) מדוללים בחלב 5% / TBST. כתמים עובדו עם כימילומינסנציה משופרת, וכימות צפיפות מבוצע באמצעות תוכנת ImageJ.

Sulforaphane הוא כימיקל מאוסף isothiocyanate של חומרים organosulfur המתקבל ירקות cruciferous, כולל ברוקולי, כרוב, כרובית, כרוב, collards, בין היתר. Sulforaphane מיוצר כאשר myrosinase האנזים הופך glucoraphanin, glucosinolate, לתוך sulforaphane, הידוע גם בשם sulforaphane-glucosinolate. נבטי ברוקולי וכרובית יש את הריכוז הגבוה ביותר של glucoraphanin או מבשר sulforaphane. מחקרים הראו כי sulforaphane משפר את יכולתו של הגוף האנושי נוגדי חמצון כדי למנוע בעיות בריאותיות שונות. ד"ר אלכס Jimenez DC, תובנה CCST

Sulforaphane והשפעותיו על סרטן, תמותה, הזדקנות, מוח והתנהגות, מחלות לב ועוד

Isothiocyanates הם כמה תרכובות צמח החשוב ביותר שאתה יכול לקבל בתזונה. בסרטון זה אני עושה את המקרה המקיף ביותר עבור אותם כי היה אי פעם. טווח קשב קצר? דלג לנושא המועדף עליך על ידי לחיצה על אחת מנקודות הזמן הבאות. ציר זמן מלא להלן.

מקטעי מפתח:

• 00: 01 - סרטן ותמותה
• 00: 19 - הזדקנות
• 00: 26: 30 - המוח וההתנהגות
• 00: 38 - סיכום סופי
• 00: 40 - מינון

ציר זמן מלא:

• 00: 00: 34 - מבוא של sulforaphane, מוקד עיקרי של הסרטון.
• 00: 01: 14 - הצריכה של הצומח הצמח והפחתת בתמותה מכל הסיבות.
• 00: 02 - סיכון לסרטן הערמונית.
• 00: 02 - סיכון לסרטן שלפוחית ​​השתן.
• 00: 02 - סרטן הריאה אצל מעשנים מסתכן.
• 00: 02 - סיכון לסרטן השד.
• 00: Hypothetical: מה אם כבר יש לך סרטן? (התערבות)
• 00: 03: 35 - מנגנון מתקבל על הדעת המניע את הנתונים התמותה הסרטן ותמותה.
• 00: 04 - Sulforaphane וסרטן.
• 00: 05: 32 - ראיות לבעלי חיים המראים השפעה חזקה של ברוקולי לנבוט לחלץ על התפתחות שלפוחית ​​השתן בעכברים.
• 00: 06 - השפעת תוסף ישיר של sulforaphane בחולי סרטן הערמונית.
• 00: 07: 09 - ביואקומולציה של מטבוליטים איסוציאיאנט ברקמת השד בפועל.
• 00: 08: 32 - עיכוב של תאי גזע סרטן השד.
• 00: 08: 53 - שיעור היסטוריה: brassicas הוקמו כבעלי תכונות בריאותיות גם ברומא העתיקה.
• 00: 09 - היכולת של Sulforaphane כדי לשפר את הפרשת מסרטן (בנזין, acrolein).
• 00: 09 - NRF51 כמתג גנטי באמצעות רכיבי תגובה נוגדי חמצון.
• 00: 10 - כיצד NRF10 ההפעלה משפר הפרשת מסרטן באמצעות גלוטתיון- S-conjugates.
• 00: 10: 34 - נבטים בריסל להגדיל גלוטתיון- S-transferase ולהפחית נזק ל- DNA.
• 00: 11 - ברוקולי לנבוט משקה מגביר הפרשת בנזין על ידי 20%.
• 00: 13: 31 - ברוקולי לנבוט homogenate מגביר אנזימים נוגדי חמצון בדרכי הנשימה העליונות.
• 00: 15: צריכת הצליבה הצמחית ותמותה ממחלות לב.
• 00: 16 - ברוקולי נובט אבקת משפר את רמת השומנים בדם ואת הסיכון למחלות לב כל סוג של חולי סוכרת מסוג 55.
• 00: 19 - תחילת סעיף ההזדקנות.
• 00: 19 - דיאטה עשירה ב- Sulforaphane משפרת תוחלת חיים של חיפושיות מ- 21 ל- 15% (בתנאים מסוימים).
• 00: 20 - חשיבותה של דלקת נמוכה לאריכות ימים.
• 00: 22: CROCiferous ירקות ברוקולי נבט אבקה נראה להקטין מגוון רחב של סמנים דלקתיים בבני אדם.
• 00: 23: 40 - סיכום וידאו: סרטן, קטעים מזדקנים
• 00: 24: 14 - מחקרים שנעשו על ידי עכברים מצביעים על כך ש- sulforaphane עשוי לשפר את תפקוד המערכת החיסונית הזקנה בגיל מבוגר.
• 00: 25 - שיפור צבע השיער גדל במודל עכבר של מקריח. תמונה ב 18: 00: 26.
• 00: 26 - התחלה של המוח והתנהגות סעיף.
• 00: 27: 18 - השפעת ברוקולי לנבוט לחלץ על אוטיזם.
• 00: 27: 48 - השפעת glucoraphanin על סכיזופרניה.
• 00: 28: 17 - תחילת הדיון בדיכאון (מנגנון ומחקרים סבירים).
• 00: 31 - מחקר עכבר באמצעות 21 דגמים שונים של לחץ המושרה על-ידי דיכאון הראה sulforaphane ביעילות דומה כמו fluoxetine (prozac).
• 00: 32: 00 - מחקר מראה בליעה ישירה של glucoraphanin בעכברים הוא יעיל באופן דומה במניעת דיכאון מ תבוסה חברתית מודל הלחץ.
• 00: 33 - תחילתו של קטע neurodegeneration.
• 00: 33 - Sulforaphane ואלצהיימר.
• 00: 33 - Sulforaphane ומחלת פרקינסון.
• 00: 33 - Sulforaphane והונגטינגטון.
• 00: 34: 13 - Sulforaphane מגביר את החלבונים בהלם חום.
• 00: 34 - תחילתו של סעיף פגיעה מוחית טראומטית.
• 00: 35: 01 - Sulforaphane מוזרק מיד לאחר TBI משפר זיכרון (מחקר העכבר).
• 00: 35: 55 - Sulforaphane ופלסטיות עצבית.
• 00: 36: 32 - Sulforaphane משפר את הלמידה במודל של סוכרת מסוג II בעכברים.
• 00: 37: 19 - Sulforaphane ו Duchenne ניוון שרירים.
• 00: 37: עיכוב מיוסטטין בתאי לווין שרירים (במבחנה).
• 00 - 38: 06: סיבת וידאו מאוחרת: תמותה וסרטן, נזק ל- DNA, מתח חמצוני ודלקת, הפרשת בנזן, מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, השפעות על המוח (דיכאון, אוטיזם, סכיזופרניה, ניוון מוחי), נתיב NRF2.
• 00: 40 - מחשבות על חישוב מנה של נבטי ברוקולי או sulforaphane.
• 00: 41: אנקדוטות על הנבטה בבית.
• 00: על טמפרטורת בישול ופעילות sulforaphane.
• 00: 43: 45 - חיידקי הבטן המרה של sulforaphane מ glucoraphanin.
• 00: 44 - תוספי מזון טובים יותר בשילוב עם מירוזינאז פעיל מירקות.
• 00: 44 - טכניקות בישול וירקות cruciferous.
• 00: 46 - Isothiocyanates כמו goitrogens.

תודות

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

איך הוא Sulforaphane מיוצר?

חימום מפחית את פעילות החלבון Epitiospecifier ומגביר את תצורת Sulforaphane בברוקולי

תַקצִיר

סולפוראפאן, איזותיוציאנט מברוקולי, הוא אחד החומרים החומרים המסרטנים החזקים ביותר שמקורם במזון. תרכובת זו אינה קיימת בירק השלם, אלא היא נוצרת ממבשר הגלוקוזינולאט שלה, גלוקוראפנין, על ידי פעולת המירוזינאז, אנזים תיוגלוקוזידאז, כאשר רקמת הברוקולי נמעכת או נלעסת. עם זאת, מספר מחקרים הוכיחו שתפוקת הסולפורפאן מגלוקוראפנין נמוכה, וכי אנלוג ניטריל לא ביואקטיבי, סולפורפן ניטריל, הוא מוצר ההידרוליזה העיקרי כאשר רקמת הצמח נמעכת בטמפרטורת החדר. עדויות עדכניות מצביעות על כך שבארבידופסיס, היווצרות ניטריל מגלוקוזינולטים נשלטת על ידי חלבון רגיש לחום, חלבון אפיתיוספייסר (ESP), גורם גורם לא-קטליטי של מירוזינאז. המטרות שלנו היו לבחון את ההשפעות של חימום פרחי ברוקולי ונבטים על היווצרות סולפורפאן וסולפורפאן ניטריל, כדי לקבוע אם ברוקולי מכיל פעילות ESP, ואז לתאם שינויים תלויי חום בפעילות ESP, תכולת סולפורפן וביו-אקטיביות, כפי שנמדד על ידי אינדוקציה של שלב II אנזים רעלים רעלים של קינון (QR) בתרבית תאים. חימום פרחי ברוקולי טריים או נבטי ברוקולי ל 60 מעלות צלזיוס לפני ההומוגניזציה הגביר במקביל את היווצרות הסולפורפאן וירידה ביצירת ניטריל הסולפורפן. הפסד משמעותי בפעילות ה- ESP מקביל לירידה ביצירת ניטריל הסולפורפני. חימום ל -70 מעלות צלזיוס ומעלה הוריד את היווצרות שני המוצרים בפרחי הברוקולי, אך לא בנבטי הברוקולי. האינדוקציה של QR בתאי hepatoma Hepa lclc7 של עכבר מתורבת מקבילה לעלייה ביצירת סולפורפאן.

חימום מראש של פרחי ברוקולי ונבטים ל -60 מעלות צלזיוס הגביר באופן משמעותי את היווצרות זרז הסולפורפן (SF) בתמציות רקמות ירקות לאחר ריסוק. זה היה קשור לירידות ביצירת סולפורפאן ניטריל (SF Nitrile) ופעילות חלבון epithiospecifier (ESP).

מילות מפתח: ברוקולי, Orolacea Brassica, Cruciferae, סרטן, Anticarcinogen, Sulforaphane, Sulforaphane ניטריל, חלבון Epithiospecifier, רדוקטאז Quinone

לסיכום, סולפוראפאן הוא חומר פיטוכימי המצוי בברוקולי, ובירקות מצליבים אחרים. כמות בלתי מבוקרת של חומרים מחמצנים הנגרמת על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד עלולה לגרום למתח חמצוני בגוף האדם אשר עלול בסופו של דבר להוביל למגוון בעיות בריאותיות. Sulforaphane יכול להפעיל את הייצור של Nrf2, גורם שעתוק המסייע לווסת מנגנוני נוגדי חמצון מגנים השולטים בתגובת התא לחמצונים. היקף המידע שלנו מוגבל לבעיות בריאות כירופרקטיקה ובעמוד השדרה. כדי לדון בנושא, אל תהסס לשאול את ד"ר חימנז או ליצור איתנו קשר בכתובת 915-850-0900 .

אושר על ידי ד"ר אלכס Jimenez

הפניה מ: Sciencedirect.com

דיון בנושא נוסף: "כאבי גב חריפים

כאב גבזהו אחד הגורמים השכיחים ביותר לנכות וימי החמצה בעבודה ברחבי העולם. כאבי גב מייחסים את הסיבה השנייה בשכיחותה לביקורים במשרדי רופאים, שנמצאים במספרם רק בזיהומים בדרכי הנשימה העליונות. כ- 80 אחוז מהאוכלוסייה יחוו כאבי גב לפחות פעם אחת במהלך חייהם. עמוד השדרה הוא מבנה מורכב המורכב מעצמות, מפרקים, רצועות ושרירים, בין השאר רקמות רכות. מסיבה זו, פציעות ו / או מצבים מחמירים, כגון דיסקים, יכול בסופו של דבר להוביל תסמינים של כאבי גב. פציעות ספורט או פציעות תאונות דרכים הם לעתים קרובות הגורם השכיח ביותר של כאבי גב, עם זאת, לפעמים הפשוטה ביותר של תנועות יכול להיות תוצאות כואבות. למרבה המזל, אפשרויות טיפול אלטרנטיביות, כגון טיפול כירופרקטי, יכולות לעזור להקל על כאבי גב באמצעות שימוש בהתאמות השדרה ומניפולציות ידניות, ובסופו של דבר משפרות את תחושת הכאב.

EXTRA EXTRA | חשוב נושא: מומלץ אל Paso, TX Chiropractor

***